體外神經組織細胞的培養已成為神經生物學研究中十分有用的技術手段。神經細胞培養需要*的營養條件，對于底物的選擇也比其他細胞苛刻。神經細胞在未處理的玻璃或塑料上不能很好地存活，但在膠原蛋白或D一多聚賴氨酸內能向外長出軸突。多肽神經因子和神經膠質細胞分泌的因子促進軸突生長。神經組織(nervous tissue)由神經元(neuron)和神經膠質細胞(netaroglia cell)組成。神經元是高度分化的細胞，在體外培養條件下難以增殖。因此，目前神經元的培養主要用于原代培養。

一、神經元的培養

(一)材料

．材料來源新生大鼠腦組織。

2．手術器械解剖剪、解剖鑷、眼科剪和眼科鑷。

3．24孔培養板和蓋玻片使用前用0．0％PLL處理蓋玻片，室溫過夜。無菌蒸餾水清洗后，紫外線照射滅菌。

4．清洗液HBSS，添加20萬IU／L和200rng／L。

5．消化液O．05％。

6．培養液

()接種培養液：DMEM，添加0％HS O．mmol／L丁二胺、33mmol／L葡萄糖、60mg／L、孕酮、0萬I U／L和00mg／L。

(2)維持培養液：DMEM，添加5％FBS、0％HS 0．mmol／L丁二胺、33mmol／L葡萄糖、60nng凡孕酮、0mmol／L丙酮酸鈉、5mg／L胰島素、00mg／L轉鐵蛋白、0．％卵白蛋白、0μg／L NGF一β、0萬I U／L和00mg／L。

(二)方法

．取材采用生后l周以內的新生大鼠，頸內動脈放血處死后，取腦組織，置于無菌平皿內。然后，用預冷的HBSS沖洗腦組織3次。在解剖顯微鏡下，剝離軟腦膜和血管，取皮質。將皮質腦成mm3左右的小塊。

2．消化將組織塊放人0．05％中，在37℃水浴中振蕩消化30min。用吸管輕輕吹打，然后用不銹鋼網濾出組織塊。

3．細胞懸液制備用HBSS收集組織塊，將組織塊研碎，用吸管反復吹打，制成細胞懸液。然后，移人5ml離心管中，室溫下靜置0min后棄上清液，重復沖洗細胞3次。向離心管內細胞沉淀中加入5ml培養液，用吸管反復吹打，離心(000r／min，lOmin)。

4．培養細胞棄去上清液，用培養液懸浮沉淀細胞，將細胞鋪于培養板中的蓋玻片上，在37℃條件下靜置培養。每隔2～3d換液次。

(三)結果觀察

    培養24h后，大部分神經元已貼壁生長。神經元胞體呈圓形或長桿狀，核大而圓，核仁明顯。可見有細小突起從胞體長出。3～5d后，細胞突起明顯變長。lOd后，細胞聚集成束，并開始退化。可用微管相關蛋白、神經元特異性烯醇化酶和神經絲等免疫細胞化學方法鑒定神經元，培養的細胞中95％以上為神經元細胞。

(四)注意事項

    培養液中需加入高濃度的葡萄糖，以利于神經元的生長。如需維持神經元生長較長時間，可將蓋玻片放在單層神經膠質細胞支持物上進行培養。